Explorarea posibilității dacă ACE2 de suprafață transportat de veziculele extracelulare poate facilita infecția cu SARS-CoV-2

Vezicule extracelulare (EV) – veziculele de dimensiuni nanometrice sunt eliberate în mod natural din celulele care nu se pot replica. Noi dovezi sugerează rolul crucial al EV-urilor în comunicarea intercelulară prin transferul de molecule bioactive de la celulele donatoare la celulele primitoare. Aceste molecule includ – acizi nucleici, proteine ​​și lipide.

Studiu: veziculele extracelulare îmbogățite cu ACE2 sporesc infecțiozitatea virusului SARS-CoV-2 viu. Credit imagine: Kateryna Kon/Shutterstock

fundal

EV-urile sunt esențiale în procesele fiziologice și patologice și au fost, de asemenea, implicate în transmiterea virală. S-a descoperit că enterovirusurile incluse în EV-uri demonstrează o eficiență mai mare în infectarea celulelor gazdă decât particulele de virus libere.

Principala cale de intrare a sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) în celulele gazdă are loc atunci când proteina virală spike (S) interacționează cu enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) a receptorului de suprafață a celulei gazdă. Deoarece expresia ACE2 este mai mare în căile respiratorii umane și în celulele epiteliale intestinale, aceste celule au o predilecție mai mare pentru invazia SARS-CoV-2.

La eliberarea din celulele infectate, furina scindează precursorul proteinei S de lungime completă la S1 și S2. După ce S2 se leagă de ACE2, S2 este apoi scindat la situsul S2′ pentru a permite intrarea virală în celulele gazdă.

ACE2 solubil (sACE2), produs după scindarea proteolitică, ar putea inhiba infecția cu SARS-CoV-2. Utilizarea de sACE2 recombinant uman cu doze mari folosind a in vitro modelul a fost testat în acest scop.

Rapoarte recente au sugerat un rol dublu al sACE2 în infecția cu SARS-CoV-2, în ceea ce privește inhibarea virală și medierea acesteia a infecției cu SARS-CoV-2 în intervalul fiziologic.

O nouă scrisoare către editor publicată în Jurnalul veziculelor extracelulare a explorat dacă ACE2 de suprafață transportat de EV poate facilita intrarea SARS-CoV-2 în celulele gazdă.

Pentru acest studiu, liniile celulare 293T și Vero E6 au fost obținute din American Type Culture Collection. Au fost preparate celule 293T care supraexprimă ACE2; 5 × 105 celule 293T au fost transfectate cu 1 μg de plasmidă care exprimă ACE2 și Lipofectamine 2000. 293T transfectate cu un vector gol a format controlul (CTL). EV-urile au fost colectate din mediu condiționat.

Rezultate

Vehiculele electrice care conțin ACE2 îmbunătățesc eficiența infecției cu virusul SARS-CoV-2 viu

EV-urile care conțin ACE2 au fost obținute prin cultivarea celulelor 293T supraexprimate cu ACE2 (ACE2-OE) în ser fetal bovin (FBS) epuizat de EV. ACE2 transmembranar de lungime completă a fost găsit în celule; au fost observate două forme scindate suplimentare de ACE2 în mediul de cultură.

Formele glicozilate ale proteazelor transmembranare serină 2 și 4 (TMPRSS2 și TMPRSS4) – care scindează subunitățile S2 – au fost găsite în lizatele totale de celule, în timp ce doar dimensiunile prezise ale acestor enzime au fost prezente în EV.

O examinare mai atentă a EV-urilor din ambele celule a arătat eliberarea unui număr echivalent de particule și mărimea modului similar prezentată – prin microscopia electronică. La aplicarea testului de creștere multiciclu, virionii infecțioși au fost generați la aproape șase ore după infecție; acești descendenți ar putea infecta alte celule. După aceea, EV-urile completate după infecție ar permite runde ulterioare de infestări celulare.

De remarcat, infectivitatea celulelor Vero E6 de virusul SARS-CoV-2 viu (amestecat cu ACE2-OE-EV) a crescut la 24 de ore după infecție, ceea ce a fost în concordanță cu încărcătura virală. În ciuda creșterii cantității de EV, CTL-EV nu a modificat infecția. Între timp, o diferență semnificativă de infecțiozitate a celulelor Vero E6 de SARS-CoV-2 cu sau fără VE nu a putut fi identificată la o oră după infecție.

Inhibarea absorbției EV scade eficiența infecțioasă a virusului SARS-CoV-2 viu

Descoperirile anterioare delimitează celulele care asimilează EV-urile prin căi endocitare. Pentru a confirma dacă EV-urile facilitează îmbunătățirea infecțiozității SARS-CoV-2, medicamentele inhibitoare care vizează diferite căi de absorbție a EV au fost testate pe celulele Vero E6.

În special, IEAP (5-[N-ethyl-N-isopropyl] amilorida) previne micropinocitoza; filipina previne endocitoza mediată de lipide; Citocalasina D permite depolimerizarea citoscheletului de actină, iar bafilomicina A1 (BafA1) reduce ATPaza H+ vacuolară. S-a observat că celulele Vero E6 obstrucționează absorbția EV cu până la 60% după tratamentul cu oricare dintre acești inhibitori.

Infectivitate virală a fost îmbunătățită semnificativ în tratamentul simulat cu ACE2-OE-EV, dar nu cu CTL-EV, așa cum se arată A trece prin Analiza RT-qPCR. Acest rezultat a indicat că ACE2 exprimat pe vehiculele electrice a activat intrarea SARS-CoV-2.

Tratamentul cu citocalasina D a redus infecțiozitatea în grupurile CTL-EV și ACE2-OE-EV; efectul a fost dependent de doză. În plus, bafilomicina A1 (BafA1) a redus semnificativ infecțiozitatea SARS-CoV-2 indusă de ACE2-OE-EV.

Concluzie

Rezultatele acestui studiu au evidențiat că vehiculele electrice îmbogățite cu ACE2 au o eficiență crescută în facilitarea pătrunderii virale SARS-CoV-2 în comparație cu vehiculele electrice de control cu ​​ACE2 nesemnificativ. Această infecțiozitate crescută ar putea fi redusă de inhibitori care concurează cu diferitele căi de intrare în EV.

În plus, vehiculele electrice pot facilita răspândirea directă a componentelor SARS-CoV-2. În plus, celulele infectate cu SARS-CoV-2 ar putea genera vehicule electrice care conțin componentele virale și ar putea acționa ca vehicule pentru livrarea directă a particulelor virale, ceea ce duce la creșterea infecției în micromediu.

.

Add Comment